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引言

近年来，肿瘤治疗已从传统广谱放化疗模式，逐步迈入以分子靶点为核心的精准医疗时代。EGFR抑制剂、HER2单克隆抗体等单靶点药物，虽在特定患者群体中展现出显著疗效，为部分患者带来了长期生存获益，但受限于肿瘤本身的异质性、动态进化特性，以及肿瘤细胞内复杂的信号调控通路，易导致患者出现原发性或继发性耐药，进而显著降低治疗效果，限制患者的最终治疗获益。为突破这一临床瓶颈，双靶点治疗策略逐步兴起并快速发展，其中双特异性抗体（BsAbs）以及由此进化而来的双抗ADC药物，凭借独特的作用机制，成为当前双靶点治疗领域最核心、最具潜力的技术路径。而这类双靶点疗法能够有效发挥协同抗肿瘤作用的关键前提，是两个目标靶点在组织及细胞层面实现时空重叠表达——也就是在多数患者的肿瘤组织中同时存在、甚至异常过表达，即“靶点共表达”。

靶点共表达并非肿瘤组织中的罕见现象，但值得注意的是，在不同癌种、不同分子亚型以及不同的靶点组合中，其共表达频率存在显著差异。如果盲目将双特异性抗体应用于仅单一表达目标靶点的肿瘤组织，药物预设的协同治疗效应将被显著弱化，难以达到预期治疗效果。因此，“靶点组合”的共表达率，是评估双靶点药物开发可行性的核心生物学指标；精准明确靶点共表达的比例、空间分布关系，更是对双靶点药物研发各阶段的决策具有重要的指导意义。基于此，本文将围绕肿瘤细胞表面蛋白共表达的生物学内涵、概念分类与检测方法，提出面向双靶药物研发的功能性共表达框架，并深入讨论其在靶点组合筛选、分子形式选择、安全性评估及患者分层中的转化价值与现存挑战。

 

一、肿瘤细胞表面蛋白共表达的共表达的生物学内涵：定义与基本模式

1. 定义

癌细胞表面蛋白的共表达，具体是指两种或两种以上特定蛋白标志物在单个癌细胞的质膜上同时存在，且具有功能关联。这些蛋白通常隶属于同一信号网络，通过协同作用推动肿瘤发生发展。从本质来看，这是肿瘤细胞为满足自身增殖、侵袭、免疫逃逸等生存需求，借助信号通路协同调控，形成的特异性分子表型。例如在尿路上皮癌中，Trop2与Nectin4的共表达，可通过协同激活下游信号通路，显著增强肿瘤细胞的恶性潜能，且这种共表达模式还具有明显的组织亚型特异性。简言之，“共表达”就是表达水平存在显著统计相关性的分子对或分子组合，它能揭示出分子间潜在的共同调控关系、生物过程参与情况或功能联系^[1]。

2. 肿瘤细胞共表达的三种形式

1）互斥型：两个靶点几乎不会在同一细胞中共存，这种模式常提示两者存在功能冗余，或调控着不相容的致癌通路。因癌基因驱动冗余或不相容的肿瘤发生途径，符合“Goldilocks原则”（即激活不足或过度激活，均不利于肿瘤的发生发展）。

2）依赖/协同型表达：一个靶点的表达或活化，依赖于另一个靶点的存在，这一模式反映出两者在同一信号网络中的耦联关系。这种关联多源于两者共处于同一信号通路，或存在转录/翻译调控、反馈调节等机制，如EGFR与HER3。

3）独立/随机型：两个癌基因的表达互不影响，是癌症中最常见的共表达类型，符合简单进化模型（即恶性细胞通过激活多个癌基因获得生存优势），在数学上满足P(A∩B)=P(A)×P(B)的概率关系。需要注意的是，这些共表达模式并非静态不变，而是会在治疗压力和肿瘤克隆演化过程中持续重塑^[2]。

3. 面向双靶药物开发的功能性共表达框架

为了更好地服务于双靶药物研发决策，有必要将生物学层面的共表达概念，转化为功能导向的分类框架。基于空间尺度和药物作用机制，可将其归纳为以下三类（图1）：

图1：共表达的表现型和评估方法

1）同一细胞共表达：指同一肿瘤细胞中同时存在A+ / B+两种靶点。目前，双靶ADC药物多基于这种机理设计，核心目的是通过双抗结合增强受体内吞，提升靶向选择性与payload递送效率。典型案例如EGFR × HER3 双靶 ADC：Izalontamab brengitecan（Iza-Bren / BL-B01D1）。

2）空间共定位共存型：并非同一细胞表达两种靶点，而是在肿瘤组织中，不同类型细胞或结构在同一区域紧密存在，且相互影响，这类共表达主要利用邻近效应或微环境优化治疗效果。目前阶段，相关双靶ADC的临床报道相对较少，更多还处于早期探索或临床前阶段。例如，多项预临床研究显示，HER2 × EGFR双靶ADC在肿瘤细胞中具有内吞活性与抗肿瘤活性，能够覆盖表达单一靶点的细胞亚群^[3]。

3）异质覆盖型共表达：肿瘤组织中不同细胞亚群，分别表达不同的目标靶点。这类共表达相关的药物研发，多集中在临床前研究或早期临床阶段。比如，MET和RON的异质性共表达是PDAC（胰腺癌）和TNBC（三阴性乳腺癌）的关键病理特征；对应的双靶点ADC（PCMdt-MMAE）具有良好的PK特征、安全性和靶向性，能有效覆盖MET/RON异质性表达的肿瘤细胞。它通过诱导受体内化、细胞周期阻滞和大规模细胞死亡，实现持久的肿瘤抑制，且对单靶点ADC难以覆盖的异质性表型同样有效^[4]。

 

二、双靶点共表达的实验检测技术

在多靶点药物研究过程中，肿瘤组织的基因/蛋白共表达确认至关重要。它直接决定着靶点选择、药物分子优化，以及适应症的确认。共表达检测方法有多种，比如传统的IHC和Fish技术，在临床适应症筛选中应用广泛。然而近年来，随着双靶点药物开发的需求增加，共表达检测技术也快速进步，出现了单细胞测序、多重免疫组织化学（mIHC）和超多重免疫荧光（IF）等新方法。研究者往往会根据研究目的、样本类型和检测需求，选择合适的检测方法，甚至多种方法联合使用，以提高检测的准确性和可靠性。本文结合新技术发展方向，重点介绍三种文章中常见的检测方法。

1. 单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）：是一种剖析肿瘤内基因表达异质性的强大工具。

通过在单个细胞水平上分析转录组，不仅能够识别不同的恶性亚群和肿瘤微环境细胞类型。其单细胞分辨率，也为研究特定肿瘤亚群内的多个癌基因转录本提供了机会，并能确认给定样本中共表达的异质性。然而，这种方法也存在局限：癌基因的mRNA表达并不总是与致癌蛋白水平相关，这限制了它充分捕捉功能性癌基因活性的能力。此外，scRNA-seq的成本较高，限制了其可扩展性，使其在评估癌基因共表达临床相关性所需的大样本量研究中，并不切实际^[2]（图1）。

2. 蛋白水平多重免疫组织化学（mIHC）：这种方法能够在单细胞分辨率下，研究癌基因蛋白的共表达，且具有高灵敏度和可扩展性。

单一IHC免疫组化技术，主要用于检测组织载玻片中的单个蛋白靶点，是病理诊断和研究的重要工具。与之相比，mIHC允许在单一组织载玻片中，同时检测多个蛋白质靶点，能提供蛋白质表达和相互作用的全面视角。选择这种技术，需根据研究需求、关注的蛋白质靶点数量，以及所研究微观环境的复杂性来决定。同时，mIHC与福尔马林固定、石蜡包埋样本兼容——这类样本在临床资料库中广泛存在，这有助于开展大规模分析，还具备将癌基因共表达与临床结果关联起来的统计效力。并且结合先进的计算细胞分割和表型分析算法，mIHC还能保留空间背景，从而允许对肿瘤内异质性进行复杂研究。例如，探究共表达特定癌基因的肿瘤细胞亚群，是否与独特的微环境生态位相关^{[6, 7]}（图2）。

图2：蛋白质水平的多重免疫组织化学（mIHC）

3. 权重基因共表达网络分析（WGCNA，全称为weighted gene co-expression network analysis）：其核心原理是通过计算基因/蛋白之间的表达相关性，将具有相似表达模式的分子，聚类为功能协同的模块。随后，再进一步分析这些模块与样本特征（如临床表型、治疗响应、生存状态等）之间的关联。比如，判断基因A和基因B是否在某一阶段存在相同的表达模式——两者是同时上调表达，还是同时下调表达。

该方法通常通过RNA测序（RNA-Seq）或基因芯片技术，获取肿瘤细胞的转录组数据，进而分析表面蛋白编码基因的共表达模式。它适合大规模筛选潜在靶点组合，但存在一定局限：转录水平与蛋白水平可能存在差异，需结合蛋白检测技术进行验证。其核心价值在于，能够解析多组学协同调控机制，定位驱动表型的关键功能模块，从而赋能精准治疗靶点发现，破解组学数据整合的瓶颈。

 

三、共表达在双靶药物研发中的转化意义

共表达不仅是双靶药物研发的核心生物学基础，更能直接转化为研发各环节的关键指导，贯穿从早期筛选到临床应用的全过程，具体体现在以下四点：

1. 靶点组合的可行性验证：共表达率在研发早期，起到了“生物学守门员”的关键作用。如果肿瘤组织中存在高比例的双阳性细胞，为双靶治疗策略提供了直接的生物学支持，证明该靶点组合具备研发价值；反之，若两个靶点呈现互斥表达模式，则往往提示项目研发风险过高，需谨慎评估或及时调整方向。

2. 分子形式选择：不同的共表达模式，对应着不同的最优药物分子形式，精准匹配才能最大化治疗效果。比如，高比例的同一细胞共表达，更适合开发双特异性分子；若是异质性共表达或中等水平共表达，则更适合研发双靶ADC药物，或采用双靶联合治疗策略；而空间共定位型共表达，则提示可重点开发细胞间作用型药物。

3. 安全性与正常组织风险评估：双靶药物的安全性，核心在于“靶向肿瘤、避开正常组织”，共表达分析是风险评估的关键手段。理想的双靶组合，应满足在肿瘤组织中共表达，而在正常组织中不共表达。通过系统性分析正常组织的共表达情况，能够有效预测药物潜在的on-target/off-tumor毒性，提前规避研发风险，保障药物安全性。

4. 患者分层与伴随诊断：共表达相关指标，可直接转化为临床可用的伴随诊断工具，助力精准筛选获益人群。

其中，共表达率及其空间分布，能够明确界定出最可能从双靶治疗中获益的患者人群，帮助实现精准分层治疗，同时也能显著提高临床试验的成功率，让药物更快落地应用于临床。

 

四、挑战与未来方向

尽管共表达在双靶药物研发中具有不可替代的转化价值，但目前其应用仍面临诸多主要挑战：

1. 检测与分析流程缺乏统一标准，不同研究采用的检测方法、分析思路存在差异，导致研究结果难以横向对比；

2. 阳性阈值定义具有主观性，不同研究者对共表达“阳性”的判定标准不统一，影响研究的客观性和重复性；

3. 高维空间数据的整合难度较大，共表达研究涉及基因、蛋白、空间分布等多维度数据，如何高效整合这些数据、挖掘核心信息，仍是亟待解决的问题；

4. RNA与蛋白层面存在表达不一致性，前文提到的scRNA-seq、WGCNA等方法多聚焦转录水平，而药物作用多针对蛋白层面，这种差异会影响共表达分析的准确性。

不过，共表达研究的未来前景广阔。随着高通量空间组学技术和人工智能方法的深度融合，共表达研究有望实现更高的定量精度，同时提升跨队列研究的可比性，为双靶药物研发提供更精准、更可靠的指导。

 

五、结语

肿瘤细胞表面蛋白共表达，已从单纯的描述性现象，发展为连接肿瘤生物学与双靶药物设计的核心概念。若能将共表达纳入清晰的功能性分析框架，再结合先进的空间与单细胞技术开展精准量化分析，将显著提升双靶药物研发的科学性与成功概率。未来，共表达的应用价值还将进一步深化：其不仅能用于前期判断双靶药物研发 “是否可行”，更有望成为精细化药物设计与个体化多靶点治疗的关键依据。

 

参考文献

[1]. Chekalin, E., et al., Computational discovery of co-expressed antigens as dual targeting candidates for cancer therapy through bulk, single-cell, and spatial transcriptomics. Bioinformatics advances, 2024. 4(1): p. vbae096.

[2]. Sridhar, S., A.S.Y. Chan and A.D. Jeyasekharan, Single-cell Resolved Oncogene Co-expression: From Principles to Clinical Impact. Blood cancer discovery, 2025. 6(4): p. 288-292.

[3]. Huang, H., et al., A novel anti-HER2/EGFR bispecific antibody-drug conjugate demonstrates promising antitumor efficacy and overcomes resistance to HER2- or EGFR-targeted ADCs. Investigational new drugs, 2025. 43(2): p. 262-275.

[4]. Wang, M., et al., Humanized dual-targeting antibody-drug conjugates specific to MET and RON  receptors as a pharmaceutical strategy for the treatment of cancers exhibiting  phenotypic heterogeneity. Acta Pharmacol Sin, 2025. 46(5): p. 1375-1389.

[5]. Yu, X., et al., Co-expression based cancer staging and application. Scientific reports, 2020. 10(1): p. 10624.

[6]. Sun, A.K., S. Fan and S.W. Choi, Exploring Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Techniques and Histopathology Image Analysis: Current Practice and Potential for Clinical Incorporation. Cancer medicine, 2025. 14(1): p. e70523.

[7]. Laboratories, K.D., multiplex immunohistochemistry (mIHC) platform. 2026.