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1402 Quick Cloning Kit


User Manual For Quick Cloning Kit

产品名称

Cat. No.

规格

组分

1402

Quick Cloning Kit

1402-1

50 rxns

1 tube of 4X Cloning Enzyme Premix

1402-5

250 rxns

5 tubes of 4X Cloning Enzyme Premix

储存于 -20˚C

 

概述

本产品利用特殊的重组原理,不依赖于连接酶,可实现简单、快速、高效的DNA定向克隆。载体可通过任意方法线性化,然后与两端含有15~25bp载体同源区域的PCR片段重组,反应时间短,重组效率>95%,并可实现多至5个片段的高效无缝克隆。

 

优势

♦ 可插入任意载体的任意位置

♦ 一步,简单,准确,快速地进行多片段定向克隆,反应仅需15min,效率高达95%

♦ 不依赖于连接酶,PCR产物无需酶切,无需磷酸化

♦ 无缝连接,不引入额外序列

 

克隆实验流程

I: 载体线性化,可酶切或通过PCR方法

II: 目的片段制备,PCR产物5’和 3’最末端的序列分别和线性化克隆载体两末端序列完全一致

III: 载体,目的片段按摩尔比~1:3与克隆试剂混匀,50°C孵育15~30min

IV: 反应产物转化

 

具体克隆实验操作

I: 载体线性化

线性化载体是克隆成功的重要前提,可通过酶切获得,平末端或者粘末端均可,双酶切更有利于降低背景;也可提供PCR扩增获得,高保真DNA聚合酶可避免产生不必要的突变。

II: 引物设计

目的片段扩增所需的正反向引物除含有与自身匹配的特异性序列外,均需含有与载体末端同源的15~25bp重叠序列,如需添加酶切位点,接头序列,标签序列等,可添加在二者之间。即:

PCR Forward Primer = 载体正向overlap序列(15~25bp)+中间酶切位点等序列+目的片段正向特异性序列(20~25bp)

PCR Reverse Primer = 载体反向overlap序列(15~25bp)+中间酶切位点等序列+目的片段反向特异性序列(20~25bp)

若要克隆多个目的片段,片段间引物设计原理与上相同。

III: 目的片段制备

目的产物需选用高保真DNA聚合酶进行扩增,由于PCR引物通常较长,退火温度可根据特异性区Tm值及聚合酶本身确定。

IV: 克隆反应体系

 

Recommended Amount

4X Cloning Enzyme Premix

5 μl

Linearized vector

40~80ng

Inserts

载体ng数*3*片段大小(bp)/载体大小(bp)=ng

Total Volume

20 μl

反应物轻轻混匀后,50°C 15~30min。反应结束后可直接用于后续转化或者-20°C保存备用。

注:

1)重组片段为2~3段时,载体与各片段加入量约为0.02 – 0.5 pmols,重组片段为4~6段时,载体与各片段加入量约为0.2 – 1 pmols,载体与加入目的片段的最佳摩尔比为1:3

2)重组片段较多时,可适当延长反应时间至1h

V: 转化

1. 把感受态细胞置于冰中解冻;

2. 加入用于转化的重组反应产物20μl ,冰中放置30min后,42℃ 热激60~90s;

3. 继续冰上放置2min;

4. 添加 500 μl S.O.C 或者 LB培养基, 37˚C 摇床培养 1 h;

5. 将转化菌液离心后弃上清,轻轻将 沉淀悬浮后均匀涂布于含有适宜抗性的LB平板上;

6. 37˚C 倒置过夜培养

 

注意事项

Problem

Probable cause

Solution

转化后菌落很少或者没有

DNA浓度太低

使用推荐的DNA用量.

目的片段或载体中含有污染.

PCR产物及线性化载体均需纯化

感受态细胞效率太低

使用效价>1×108cfu/µg 的感受态细胞效果更好

载体线性化不完全

载体切胶回收

阳性克隆较少,多为空载体

被含有相同抗性的载体污染

PCR产物中可能含有模板质粒,推荐切胶回收

平板抗性错误

确保平板新鲜配制且添加正确抗生素.

载体酶切不完全

酶切时间延长可增加线性化程度,降低背景


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