遮蔽技术是前药技术的延伸，通过对靶向分子的结合区或其偶联毒素进行遮蔽，减少靶标分子对正常组织的毒性，靶分子在肿瘤等作用部位被相关酶裂解释放原药物或酸微环境下激活恢复活性。该技术特别适用于一些分布特异性不高的靶点，目前已在抗体及抗体偶联药物、双抗TCE、CAR-T、细胞因子、多肽偶联药物等领域应用，显著降低了药物毒性、增加了安全剂量范围，一些药物已进入I-II期临床试验。本文将对遮蔽技术原理、分类及应用进展进行介绍，供抗体、多肽相关药物研发同行参考。
一、遮蔽技术原理、分类及药物研发简介
在抗体相关药物（包括抗体、双抗TCE、CAR-T）的CDR或Fc区域，用酶可裂解Linker连接抗原结合片段、底物多肽、结构多肽、小蛋白、PEG等遮蔽其部分活性（图1）[1]，或在分子中引入酸敏感基团，降低原分子的亲和力，减少其对正常组织的靶向性。当遮蔽分子进入特定微环境（如肿瘤组织）时，依赖肿瘤高表达的蛋白酶切割连接子(linker)，释放遮蔽结构，或在肿瘤酸性环境中激活，恢复抗体的本来高活性，从而减少非靶结合副作用、提高安全性。目前采用掩蔽技术研发的单抗、双抗（包括TCE）等称为Probody。
图1：遮蔽的抗体偶联物在非肿瘤组织及肿瘤组织的结合-激活示意图[1]
抗体遮蔽技术分为2类：（1）亲和力遮蔽，采用配体分子（结合多肽、底物、小蛋白）遮蔽抗体的结合部位或肿瘤酸环境激活分子；（2）物理遮蔽，采用卷曲螺旋结构域（螺旋肽片段）、聚乙烯醇、多聚SAR等形成空间遮蔽结构，部分覆盖抗体互补决定区(CDR)、铰链区、Fc区及毒素载荷等。目前进展较快的是遮蔽肽技术，Cytomx, Xilio, Janux, munix, Maverick, Harpoon在遮蔽抗体、遮蔽TCE方面取得显著进展（表1），多种药物已进入临床研究（表2）。
表1. 遮蔽技术研发公司及靶点
表2. 进入临床试验的部分遮蔽抗体相关药物
二、遮蔽技术在抗体及偶联药物的应用进展
2.1 利用可裂解多肽配体（或小蛋白）遮蔽抗体结合区
CytomX Therapeutics在轻链上引入多肽遮蔽结合位点，靶点包括PD-1、PD-L1、CD166、CD71、Trop1等[2]，多个项目已进入I-II期临床试验（表2）。Trop1在结直肠癌表达高，但在正常结直肠组织也有表达，CytomX Therapeutics研发了靶向Trop1的遮蔽抗体偶联药物CX-2051（图2），linker包含酶切序列“LSGRSDNH”[3,4]。CX -2051已完成I期临床试验(CytomX Therapeutics网站)，25名“治疗选择枯竭”的晚期结直肠癌患者接受了CX-2051治疗，其中18名可评估疗效，每三周注射一次CX-2051，剂量从2.4mg/kg到10mg/kg不等。结果显示，5人的肿瘤大幅缩小或消失，在最高剂量组（10mg/kg）的7名患者中，3人实现了肿瘤大幅缩小或消失，高达94%的患者病情得到控制。CX-2051副作用较低，大多数治疗相关的不良反应比较轻微（如腹泻、恶心），没有出现ADC常见的胰腺炎，也未发现剂量限制性毒性。
该技术已应用到很多靶点，如CTLA-4、CD137等[5-8]，遮蔽肽也可用于affibody [9]、抗体Fc[10]以及双抗TCE的遮蔽，如Janux公司在靶点结合抗体和CD3 两端分别引入遮蔽肽，该遮蔽肽含有结合白蛋白的功能区，增加半衰期。
图2：靶向Trop1的CX-2051遮蔽抗体偶联药物
（图来自CytomX Therapeutics网站）
2.2 采用双螺旋肽或普适肽进行物理遮蔽
为避开研发抗体结合肽步骤或专利，一些公司（如Vir Biotech,Amunix / Sanofi）在抗体的结合区引入可被基质金属蛋白酶2和9等裂解的螺旋肽，螺旋肽前的Linker含有酶识别序列(GPLGIAGQ)，在肿瘤组织内被切割后恢复活性。此技术已在 CD19(hBu12)(图3）、CD20(rituximab)、 HER2(trastuzumab)、integrin αVβ6(h15H3)及CD3(145-2C11)等抗体中应用[11,12]。
图3. CD19遮蔽抗体(hBu12)的结构及活性[11]
该技术也用于一些TCE遮蔽药物的设计。Amunix的XPAT抗体(EGFR×CD3)采用靶点抗体结合区和CD3双边遮蔽肽设计，分别含有可酶切linker, 遮蔽部分由亲水性氨基酸交替组成(300~500aa), 通过空间位阻遮蔽作用部位。研发的HER2/CD3双抗TCE，激活状态下对HER2的KD约为2–4nM，遮蔽后降低至约30–50nM。CD3端的KD从30–50nM 降至100–180nM，体外TDCC实验显示遮蔽与激活状态下的活性差异超过了10000倍。
2.3 刷状聚乙烯醇修饰遮蔽抗体活性
最近Nature Biotechnology报道了刷状聚乙烯醇修饰抗体Fc区域的遮蔽抗体（图4），PEG修饰后水溶性增加，显著提高了抗体的DAR值。该技术在HER3、MUC1 ADC中显示显著的抗肿瘤活性[13]。
图4. 刷状PEG修饰抗体的Fc区域[13]
2.4 在Linker上引入短的SAR或PEG，遮蔽抗体活性
适当长度的多聚SAR及PEG可以遮蔽抗体的部分活性或毒素载荷的毒性。BMS公司在CTLA-4抗体CDR区引入可酶切的PEG遮蔽抗体部分活性（图5）[14]。
图5. PEG产生空间位阻防止抗体与靶标结合（紫色部分为基质酶可切割肽），酶裂解后活性恢复[14]
2.5 pH敏感激活抗体
pH敏感抗体的研发主要有分子设计及建库筛选两条路线。分子设计方法采用抗体界面或邻近残基His替换、引入Asp/Glu或His+Asp/GLu组合突变等[15]，通过His及Asp/Glu的质子化改变电荷相互作用，获得酸性条件下具有活性但在中性条件下无活性的抗体。筛选方法是在中性及酸性条件下筛选抗体库，获得酸性条件下具有结合活性但在中性条件下不结合的抗体。BioAtla公司利用酸性激活平台开发了双抗抗体BA318(Trop1/CD3)、ADC BA3011（AXL，图6）[16]、BA3021(ROR2)[17]等，目前已进入II期临床试验。
图6. 靶向AXL的pH激活抗体BA3011在中性及酸性条件下的结合活性[16]
一些公司在抗体的结合区引入可酸解的PEG（图7）[18,19]，利用肿瘤的酸性环境脱除PEG而恢复活性。目前该方法已在靶向EGFR、HER2、AXL175、ROR2的ADC中应用。
图7. 酸解激活遮蔽PEG示意图[18]
三、小 结
遮蔽技术已在特异性不高靶点的抗体类药物研发中取得显著进展，不仅可用于ADC、双抗及其偶联药物等，也可用于CAR-T。遮蔽技术提高了抗体在肿瘤组织的特异摄取，降低了非靶毒性，使用剂量灵活，允许更高剂量给药。目前遮蔽肽技术（包括遮蔽亲和力及空间遮蔽）应用较多，采用酸敏感技术遮蔽药物还较少。常用的裂解酶包括金属蛋白酶MMP-2、-9、-13、组织蛋白酶cathepsin B、L等[20]。一些国际大公司（如Obbvie、Merck、Sanofi、Regeneron、Gilead等）及一些专业遮蔽抗体公司（如CytomX Therapeutics、Vir Biotech、Janux等）正在大力发展遮蔽抗体及相关药物，多个单抗、双抗药物进入I-II期临床试验（表2）。遮蔽技术也存在一些不足，如开发成本较高，异源遮蔽结构免疫原性、肿瘤中裂解酶对遮蔽基团裂解效率等影响抗体类药物体内活性。目前已报道一些采用遮蔽技术研发的抗体相关药物疗效不佳，如BMS的BMS-986249(CTLA-4)、CytomX的CX-029(CD71)进入II期临床试验后终止，武田公司终止了TAK-186(EGFR/CD3)及TAK-280(B7H3)的开发，Janux公司的JANX007(PSAM/CD3)的1a期临床数据显示疗效不及预期。
今后遮蔽技术药物研发仍需在如下几个方面继续发力：（1）继续探索适合肿瘤组织裂解的各种linker。由于体内酶种类和含量的不确定性，体外实验与体内实验的结果有时不一致，需要根据不同肿瘤模型进行深入筛选；（2）探索免疫原性低、通用性遮蔽多肽片段或其他合适的长链分子（如多聚SAR、PEG等），遮蔽抗体结合区或抗体偶联药物的Payload；（3）基于AI等分子设计工具，在抗体中精确引入酸敏感基团，提高酸敏感遮蔽药物的成功率。目前，多肽偶联药物采用遮蔽技术降低副作用的研究还很少，由于多肽分子小，遮蔽技术与抗体类药物遮蔽技术有所不同，采用的遮蔽基团不能太大，但前药模式、酸敏感方式（如组氨酸与其他基团组成酸敏感离子对、氢键网络等）将在遮蔽多肽偶联药物研发中取得突破。
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