产品中心
PV2 DNA Polymerase
User Manual For PV2 DNA Polymerase
|
产品名称 |
Cat. No. |
规格 |
组分 |
|
PV2 DNA 聚合酶 |
1401-1 |
250 U |
5X PV2缓冲液与聚合酶 |
|
1401-5 |
5 X 250 U |
5X PV2缓冲液与聚合酶 |
将聚合酶与缓冲液储存于-20˚C.
概述
PV2 DNA 聚合酶是一种超保真DNA聚合酶，该酶结合了杂交技术与融合技术以获得优越的可靠性、高特异性和长的目标长度性能，显著地减少全部的PCR延伸时间。通过融合一段增强区大大提高了持续合成能力，提高了PCR扩增速率，结合该酶的3’-5’核酸外切酶活性使得其保真性是普通Taq酶的数十倍。而该酶的独特结构使其即便在有PCR抑制剂存在的情况下，也能快速有效的得到目的产物。
PV2 DNA 聚合酶具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’核酸外切酶活性，PCR扩增产 物为平末端。
优势
♦ 保真度高：确保PCR复制的精确程度
♦ 快速：延伸时间短(15-30秒/kb)
♦ 方便：功能强劲，只需最少的优化
♦ 高产量：用更少的酶，获得更高的产量
应用
♦ 高保真PCR
♦ 快速PCR
♦ 高通量PCR
♦ 长片段或困难模板扩增
♦ 克隆
储存条件
20mM Tris-HCl(pH7.4 @ 25°C)，100 mM KCl，1 mM DTT，0.1mM EDTA，稳定剂，50% 甘油
反应条件
50µl反应体系中含有：1X PV2缓冲液，DNA模板，0.5µM上下游引物，0.2mM dNTP，3% DMSO(可选)，1U PV2 DNA聚合酶。
单位定义
一个单位 PV2 DNA聚合酶可在 74°C，在 30 分钟内向不溶于酸材料中掺入 10 nmol脱氧核糖核苷酸。
热失活
无
PCR扩增反应建立
为了得到理想的PCR结果，我们建议所有的试剂使用前都要充分混匀并离心，整个反应操作在冰上进行，并迅速将反应转移到预变性(98°C)的PCR循环仪上。为避免PV2 DNA 聚合酶3’-5’核酸外切酶活性引起的引物降解，PV2 DNA 聚合酶要最后加入到反应体系中。请注意，以下的操作步骤与其它标准聚合酶不同，因此以下推荐的反应条件为最佳反应条件。
注意：PCR反应建立后，将反应物吸打混匀，短暂离心将液体收集到管底。如果使用的PCR循环仪没有加热盖，可在样品上覆盖矿物油。
|
组分 |
20 µl 反应体系 |
50 µl反应体系 |
终浓度 |
|
5X PV2缓冲液 |
4 µl |
10 µl |
1X |
|
10 mM dNTPs |
0.4 µl |
1 µl |
200 µM |
|
10 µM 正向引物 |
1 µl |
2.5 µl |
0.5 µM |
|
10 µM 逆向引物 |
1 µl |
2.5 µl |
0.5 µM |
|
模板DNA |
可变 |
可变 |
< 250 ng |
|
DMSO (optional) |
(0.6 µl) |
(1.5 µl) |
3% |
|
PV2DNA 聚合酶Polymerase |
0.2 µl |
0.5 µl |
1.0 U/50 µl PCR |
|
ddH2O |
to 20 µl |
to 50 µl |
将PCR管从冰上转移至预加热(变性温度98°C)的PCR仪上开始热循环
|
循环步骤 |
温度 |
时间 |
|
预变性 |
98°C |
30 s |
|
25-35 Cycles |
98°C |
5-10 s |
|
终延伸 |
72°C |
5-10 min |
|
Hold |
4-10°C |
PCR扩增反应指南
1. 模板
使用高质量、高纯度的DNA模板可以提高PCR反应的成功率 。50ul反应体系建议的DNA模板用量建议如下：
|
DNA |
Amount |
|
基因组 |
50 ng–250 ng |
|
质粒或病毒 |
1 pg–10 ng |
如果DNA模板来自于cDNA合成反应，DNA的体积应该不超过总的反应体积的10%。
2. 引物
寡核苷酸引物长度一般为20~40nt，GC含量一般为40~60%，可以使用Primer 5等软件设计分析引物 。使用PV2 DNA聚合 酶时 ，每条引物的终浓度为0.2~1μM，建议用量是0.5μM。
3. Mg2+ 和添加剂
由于PV2 DNA 聚合酶是一种镁离子依赖型酶，故Mg2+浓度对其有着关键作用。在1X PV2缓冲液中Mg2+终浓度为1.5 mM。过量的Mg2+能稳定DNA双链结构，阻止DNA完全变性，以稳定由于引物非正确结合模板位点引起的假阳性。最佳Mg2+浓度应还受总dNTP的浓度、特定模板以及样品缓冲液成分影响。如果引物或模板中含有像EDTA或EGTA等螯合剂时，则应提高Mg2+的浓度。如需进一步优化， 可以使用MgCl2按0.5 mM浓度逐步提升调整。
对于复杂模板，如高GC含量的序列和带有复杂二级结构的序列，可以加入DMSO等添加剂提高反应效率。建议DMSO的终浓度为3%，也可以以2%的浓度递增优化。需要注意的是由于DMSO可以降低引物的Tm值 ，因此如果DMSO浓度很高， 则需要降低退火温度。PV2 DNA聚合酶也可以与其它添加剂兼容，如：甲酰胺或甘油。
4. dNTP
dNTP的反应终浓度通常是各200 μM 。在使用PV2 DNA聚合酶时，不推荐使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。
5. PV2 DNA 聚合酶
我们推荐PV2 DNA聚合酶的使用浓度是20 U/ml (1.0 U/50 μl 反应体系)。根据扩增子的长度和困难程度，可以对PV2 DNA聚合酶在10–40 U/ml (0.5–2 U/50 μl 反应体系) 之间进行优化。50 µl反应体系中PV2 DNA聚合酶的用量不要超过2 U，尤其当扩增子的长度大于5 kb时。
6. 缓冲液
随酶提供5X PV2缓冲液。当进行高保真扩增时该缓冲液是默认的推荐缓冲液。
7. 变性
我们推荐大多数模板的预变性温度及时间是98°C 与 30s。对于需要延长变性时间的模板，预变性时间可以增加到3min。
在 PCR过程中，变性时间越短越好，大多数模板通常在98°C变性时间是5~10s即可。
8. 退火
与其它PCR聚合酶相比PV2 DNA 聚合酶需要较高的变性温度 。PV2 DNA 聚合酶具有稳定引物和模板杂交的性能，当引物长度大于20nt时，退火温度在最低Tm的基础上加3°C复性10~30s;但当引物长度小于或等于20nt时，退火温度为最低的Tm。可以根据需要建立温度梯度去寻找引物和模板结合的最适温度，这个梯度温度以最低的Tm逐步提升到模板延伸温度(两步PCR)。
对于Tm较高的引物用两步PCR法可以不需要复性这一步。
9. 延伸
延伸过程在72°C进行，延伸时间取决于扩增片段的长度和模板复杂度，复杂度较低时可用15s/Kb的延伸时间;复杂度较高的基因组DNA模板，延伸时间则应为30s/Kb。对于有些cDNA模板，延伸时间可增加到40s/Kb。
10. 循环数
通常25~35个循环可以产生足够的PCR产物。
11. 两步法PCR
当引物的退火温度≥ 72°C 时建议使用两步法进行PCR扩增。
常规的两步法PCR热循环条件如下：
|
循环步骤 |
温度 |
时间 |
|
预变性 |
98°C |
30 s |
|
25-35 个循环 |
98°C |
5-10 s |
|
终延伸 |
72°C |
5-10 min |
|
Hold |
4-10°C |
12. PCR产物
使用PV2 DNA聚合酶扩增的产物为平末端，如果产物用于克隆，建议使用平末端连接。如果需要进行T/A克隆，在加A之前需要纯化DNA，因为PV2 DNA 聚合酶会降解产生的突出端。
上一页
上一页
留言咨询
需要了解关于中晟全肽的更多信息和产品，您可以通过留言或电话与我们取得联系，我们会为您提供专业的服务与产品。欢迎拨打服务热线：17373366007（市场部黄经理）
为全球多肽药物得以繁荣赋能，让多肽药得以低成本惠及全球患者，造福人类健康
