产品中心
1402 Quick Cloning Kit
User Manual For Quick Cloning Kit
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产品名称 |
Cat. No. |
规格 |
组分 |
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1402 Quick Cloning Kit |
1402-1 |
50 rxns |
1 tube of 4X Cloning Enzyme Premix |
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1402-5 |
250 rxns |
5 tubes of 4X Cloning Enzyme Premix |
储存于 -20˚C
概述
本产品利用特殊的重组原理，不依赖于连接酶，可实现简单、快速、高效的DNA定向克隆。载体可通过任意方法线性化，然后与两端含有15~25bp载体同源区域的PCR片段重组，反应时间短，重组效率>95%，并可实现多至5个片段的高效无缝克隆。
优势
♦ 可插入任意载体的任意位置
♦ 一步，简单，准确，快速地进行多片段定向克隆，反应仅需15min，效率高达95%
♦ 不依赖于连接酶，PCR产物无需酶切，无需磷酸化
♦ 无缝连接，不引入额外序列
克隆实验流程
I: 载体线性化，可酶切或通过PCR方法
II: 目的片段制备，PCR产物5’和 3’最末端的序列分别和线性化克隆载体两末端序列完全一致
III: 载体，目的片段按摩尔比~1:3与克隆试剂混匀，50°C孵育15~30min
IV: 反应产物转化
具体克隆实验操作
I: 载体线性化
线性化载体是克隆成功的重要前提，可通过酶切获得，平末端或者粘末端均可，双酶切更有利于降低背景;也可提供PCR扩增获得，高保真DNA聚合酶可避免产生不必要的突变。
II: 引物设计
目的片段扩增所需的正反向引物除含有与自身匹配的特异性序列外，均需含有与载体末端同源的15~25bp重叠序列，如需添加酶切位点，接头序列，标签序列等，可添加在二者之间。即：
PCR Forward Primer = 载体正向overlap序列(15~25bp)+中间酶切位点等序列+目的片段正向特异性序列(20~25bp)
PCR Reverse Primer = 载体反向overlap序列(15~25bp)+中间酶切位点等序列+目的片段反向特异性序列(20~25bp)
若要克隆多个目的片段，片段间引物设计原理与上相同。
III: 目的片段制备
目的产物需选用高保真DNA聚合酶进行扩增，由于PCR引物通常较长，退火温度可根据特异性区Tm值及聚合酶本身确定。
IV: 克隆反应体系
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Recommended Amount |
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4X Cloning Enzyme Premix |
5 μl |
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Linearized vector |
40~80ng |
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Inserts |
载体ng数*3*片段大小(bp)/载体大小(bp)=ng |
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Total Volume |
20 μl |
反应物轻轻混匀后，50°C 15~30min。反应结束后可直接用于后续转化或者-20°C保存备用。
注：
1)重组片段为2~3段时，载体与各片段加入量约为0.02 – 0.5 pmols，重组片段为4~6段时，载体与各片段加入量约为0.2 – 1 pmols，载体与加入目的片段的最佳摩尔比为1:3
2)重组片段较多时，可适当延长反应时间至1h
V: 转化
1. 把感受态细胞置于冰中解冻;
2. 加入用于转化的重组反应产物20μl ，冰中放置30min后，42℃ 热激60～90s;
3. 继续冰上放置2min;
4. 添加 500 μl S.O.C 或者 LB培养基， 37˚C 摇床培养 1 h;
5. 将转化菌液离心后弃上清，轻轻将 沉淀悬浮后均匀涂布于含有适宜抗性的LB平板上;
6. 37˚C 倒置过夜培养
注意事项
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Problem |
Probable cause |
Solution |
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转化后菌落很少或者没有 |
DNA浓度太低 |
使用推荐的DNA用量. |
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目的片段或载体中含有污染. |
PCR产物及线性化载体均需纯化 |
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感受态细胞效率太低 |
使用效价>1×108cfu/µg 的感受态细胞效果更好 |
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载体线性化不完全 |
载体切胶回收 |
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阳性克隆较少，多为空载体 |
被含有相同抗性的载体污染 |
PCR产物中可能含有模板质粒，推荐切胶回收 |
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平板抗性错误 |
确保平板新鲜配制且添加正确抗生素. |
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载体酶切不完全 |
酶切时间延长可增加线性化程度，降低背景 |
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